샘플 준비 및 슬롯 사이트
슬롯 사이트
ILAB에 액세스하여 슬롯 사이트 제출 및 기기 시간 예약
질량 분석 실험에서 귀중한 정보를 얻으려면 깨끗하고 신중하며 표적화된 샘플 준비가 필수적입니다. 잘 설계된 샘플 준비 슬롯 사이트은 케라틴에 의한 오염을 방지해야 하며, 관심 있는 모든 단백질을 추출해야 하며, 관심이 없는 단백질을 제거해야 합니다.
샘플은 고객이나 네바다 슬롯 사이트테오믹스 센터에서 준비할 수 있습니다. 질량 분석을 위한 완벽한 샘플에는 단백질이 포함되어 있지만 핵산, 염, 복합 탄수화물 또는 지질은 거의 포함되어 있지 않습니다.
질량분석 분석을 위한 사전분별
매우 복잡한 샘플의 경우, 샘플 내 단백질의 사전 분별 후 각 분획의 LC-MS 분석을 통해 이러한 사전 분별 없이 볼 수 있는 것보다 더 많은 단백질을 식별할 수 있습니다. 이는 일반적으로 전하를 기준으로 단백질 또는 슬롯 사이트테아제 단편을 분리하여 수행됩니다.
단백질 또는 펩타이드는 Thermo Scientific Ulti-Mate 3000 HPLC의 기본 역상 HPLC로 분리할 수 있습니다. 이 기기는 분수를 자동으로 수집한 후 분석합니다.
전하에 의한 분리를 위한 또 다른 방법은 용액 내 등전점 포커싱입니다. 시료 준비 실험실에는 이를 수행할 수 있는 두 가지 장비가 있습니다.
효소적 단백질 소화
질량 분석으로 분석되기 전에 대부분의 단백질은 더 작은 조각으로 분해되어야 합니다. 이는 일반적으로 트립신과 Lys-C와 같은 슬롯 사이트테아제를 사용한 소화를 통해 이루어지지만 원하는 다른 슬롯 사이트테아제를 사용할 수도 있습니다.
요구사항
100 fmol 단백질은 용액 속의 단백질, 쿠마시 염색으로 볼 수 있는 젤 조각 또는 반점일 수 있습니다.
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이것은 젤 내 또는 용액 내 단백질 소화를 위한 기본 슬롯 사이트입니다. 제발문의하기더 자세한 슬롯 사이트 방법을 찾고 있다면.
겔 내 소화
다음 젤 내 분해 슬롯 사이트은 최대 3 - 1mm 원형 젤 조각에 사용됩니다. 모든 젤 조각이 모든 단계에 대해 용액으로 완전히 덮이도록 추가 젤 조각으로 시작하는 경우 방법을 수정해야 합니다.
시약
- 25mM 중탄산암모늄(ABC)
- 25mM ABC 중 10mM 디티오트레이톨(DTT)
- 25mM ABC 중 100mM 요오도아세트아미드(IA)
- 20 μg 동결건조된 변형 트립신(Promega Cat# V5111)
- 0.3% 포름산(aq)
- 아세토니트릴(ACN)
방법
- 50μl ABC를 젤 플러그에 슬롯 사이트고 실온(RT)에서 5분간 배양하세요.
- 용액을 버리고 ACN 50μl를 슬롯 사이트고 실온에서 5분간 배양하세요.
- 두 단계를 모두 반복하세요.
- 용액을 버리고 40μl DTT를 슬롯 사이트고 60C로 가열한 후 10분간 배양합니다. 15분간 식혀주세요.
- 용액을 버리고 30μl IA를 슬롯 사이트십시오. 실온에서 35분간 배양하세요.
- 용액을 버리고 위에서 설명한 대로 ABC와 ACN으로 두 번 세척하십시오.
- 트립신 용액 15μl를 슬롯 사이트고 10분간 배양합니다.
- 참고: 슬롯 사이트. 트립신을 0.3% 포름산에 녹여 0.1ug/ul 용액을 만들고 25mM ABC에 5ng/ul로 희석합니다.
- 10μl ABC를 슬롯 사이트고 37C에서 4시간 동안 배양합니다.
- 15μl 0.3% 포름산을 추가합니다.
용액 내 소화
<20 μl 샘플 버퍼의 샘플로 시작합니다.
시약
- 25mM 중탄산암모늄(ABC)
- 25mM ABC 중 10mM 디티오트레이톨(DTT)
- 25mM ABC의 55mM 요오도아세트아미드(IA)
- 20 μg 동결건조된 변형 트립신(Promega Cat# V5111)
- 0.3% 포름산(aq)
- 아세토니트릴(ACN)
방법
- 20μl ACN을 슬롯 사이트고 실온에서 20분간 배양하세요.
- 40μl DTT를 슬롯 사이트고 60C로 가열한 후 10분간 배양합니다.
- 15분간 식혀주세요.
- 20μl IA를 추가합니다. 실온에서 35분간 배양하세요.
- 트립신 용액 20μl를 슬롯 사이트고 10분간 배양합니다.
- 참고: 슬롯 사이트. 트립신을 0.3% 포름산에 녹여 0.1ug/ul 용액을 만들고 25mM ABC에 5ng/ul로 희석합니다.
- 10μl ABC를 슬롯 사이트고 37C에서 4시간 동안 배양합니다.
- 20μl 0.3% 포름산을 추가합니다.